Її першим директором став Дмитро Тимофійович Мізко, видатний діяч у галузі культури та освіти Придніпров’я. Серед учнів гімназії переважали діти дворян, купців і чиновників, їх було небагато, але навчальний заклад зіграв важливу роль у розвитку Катеринослава як культурного центру. 1864 року в губернському місті нараховувалося вже 11 навчальних закладів, головним серед них залишалася гімназія з пансіоном, яка мала 232 учня, 12 учителів та вихователів. Середній випуск учнів гімназії в першій чверті ХІХ ст. становив 12–15 чоловік, згодом збільшився майже вдвічі. За сто років існування гімназії її випускниками стали 1466 осіб. Найбільша кількість учнів гімназії — 511 припала на 1883 рік.
З 1805 до 1837 рік Катеринославська гімназія була губернською, від 1837 — міською. 19 листопада 1864 р. вона отримала статус міської класичної, а з 1911 року стала називатися 1-ою класичною чоловічою гімназією. Взагалі ж статут гімназії за сто років її діяльності змінювався п’ять разів у зв’язку зі змінами в суспільстві та потребами освіти. Особливої уваги тут надавали вивченню класичних мов та класичної літератури. Курс навчання в гімназії спочатку був чотирирічним, згодом вона була перетворена на семикласну. 1871 р. утворився 8-й клас та один підготовчий. На початку ХХ ст. навчальний курс складався вже з 9 років: підготовчий та 8 основних.
У першій чверті ХІХ ст. учні гімназії вивчали латинську, німецьку та французьку мови, історію, географію, початковий курс філософії та словесності, математику, фізику, природознавство, політекономію, малювання. Бажаючі присвятити себе військовій службі вивчали також фортифікацію та артилерію. 1828 р. з навчальних планів були вилучені природознавство, філософія, політекономія, натомість введено Закон Божий, священну та церковну історію, грецьку мову. З виникненням спеціальних навчальних закладів для військових інженерів, з програми гімназії зникли курси фортифікації та артилерії.
У катеринославській гімназії працювали видатні діячі на ниві народної освіти Дмитро Мізко, Яким Ковалевський, Яків Грахов та інші.
При гімназії було створено велику бібліотеку, на момент відкриття вона налічувала 8737 томів, у 1812 р. з Лейпцигу виписали ще 305 книжок грецькою, латинською, французькою та німецькою мовами. До складу бібліотеки потрапили й книги з бібліотеки Г.О. Потьомкіна.
Спочатку чоловіча гімназія містилася в дерев’яній будівлі на розі Проточної (Леніна) та Дворянської (Плеханова) вулиць. Зі зростанням міста виникла нагальна потреба в новій, більшій за обсягом та краще пристосованій будівлі. 1861 року на Соборній площі було побудовано новий кам’яний двоповерховий будинок гімназії (сучасна адреса — Жовтнева площа, 2), за проектом архітектора І.М. Скотнікова. Нині ця будівля у стилі російського класицизму середини ХІХ ст. є пам’яткою архітектури національного значення.